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FUJIFILM wako | ClearSee? 植物科學新技術 植物透明化試劑

植物科學新技術 植物透明化試劑                                                                     wako

ClearSee?



ClearSee是一種僅需固定、洗凈、透明化三步簡單操作即可實現植物組織透明化的試劑。作為植物科學的研究工具,期待可以闡明細胞水平的現象和整個個體之間的系統聯系。


HP數據:由名古屋大學大學院理學研究科 栗原大輔特任助教、水多陽子研究員提供


031-25151


◆操作步驟


使用 ClearSee? 的透明化方法,只需1)固定、2)洗凈、3)透明化三個步驟。詳細方法可參考隨產品附贈的使用說明書。

以下,是擬南芥葉和幼株的使用案例。


1. 固定


① 使用4%甲醛溶液固定樣本*1。

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② 將樣本放入干燥機中,用真空泵減壓,在室溫下靜置30分鐘,并固定。

② 以上操作重復兩次。

② 為了防止植物樣品在減壓過程中飛出,建議打開管蓋,用封口膜密封,并用針在上面扎孔*2,3。


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2. 洗凈


去除固定液,加入1 mL的1×PBS緩沖液,靜置1分鐘。然后去除1×PBS緩沖液,重新加入1 mL的1×PBS緩沖液,靜置1分鐘。

以上操作重復兩次。



3. 透明化處理


去除1×PBS緩沖液,添加1.3 mL的ClearSee?。

打開管蓋后用封口膜密封,并用針在上面扎孔。放入干燥機中,用真空泵減壓,并在室溫下靜置1小時。

取下封口膜,蓋好管蓋。避光,室溫靜置,透明化*4。

如有需要可更換新的ClearSee?。



4. 透明化過程


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圖4. ClearSee?中的擬南芥葉和幼株



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圖5. 可以觀察到樣本周圍葉綠素(1-2天后)



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圖6. 更換新的 ClearSee? 后的樣本



圖7. 透明化的擬南芥葉和動株(3-5天后)




使用ClearSee進行透明化需要的物品


1. 高壓滅菌鍋

2. 局部排氣系統(通風室等)

3. 真空泵

4. 干燥機

5. 60°C 恒溫器

6. 熒光顯微鏡

7. 錐形管

8. 微量離心管

9. 封口膜

10. 針

11. 鑷子

12. 蓋玻片

13. 載玻片

14. 凡士林油


注意


※ 由于植物活體樣本含有空氣,添加溶液時植物就會漂浮起來。請盡可能地將植物樣本浸入固定液中。

※ 請將干燥機設定在-90 kPa左右。根據植物樣本的不同,有時減壓會過強。減壓過強的話,會破壞植物組織和細胞。開始減壓后,由于會抽出植

※ 物樣本中的空氣,會產生氣泡。為了讓氣泡消失,請緩慢調整減壓的壓強。

※ 從減壓狀態恢復至大氣壓強時,請緩慢進行。如果急速恢復至大氣壓強的話,會破壞植物組織和細胞。

※ 透明化的時間根據植物種類和組織而異,請參照以下的時間。

※ 根:1~2天、葉和幼株:4~7天、雌蕊:2周、成熟組織:4周。



◆觀察案例


5. 觀察


在載玻片上用凡士林或油脂制作一個圍欄,放入適量 ClearSee?,用鑷子將樣本移入,蓋好蓋玻片,并用熒光顯微鏡觀察。由于 ClearSee?干燥后會產生沉淀,所以用凡士林或油脂來防止其干燥。觀察結束后,可以將植物樣本放回裝有 ClearSee? 的微管中進行保存。

另外,用 ClearSee? 透明化的樣本亦可用熒光色素進行染色。細胞核染色時,向 ClearSee? 中添加終濃度為 10 μg/ mL 的雙苯甲酰亞胺 H33258 三鹽酸鹽,雙苯甲亞胺 H33342 或 DAPI,細胞壁染色時,使用終濃度為 1 mg/mL,靜置1小時后,更換新的 ClearSee? ,再靜置1小時后,在熒光顯微鏡下進行觀察。


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8. 經透明化處理的擬南芥葉在明場中呈透明狀態,葉綠素的紅色自發熒光消失。

圖8.  由于可以對整片葉進行觀察,因此也可以觀察到維管束內的熒光蛋白。比例尺為 200 μm。



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圖9使用 ClearSee? 透明化的完整的雌蕊的熒光觀察。

圖2. 用4個顏色(藍色,綠色,黃色,紅色)的熒光蛋白標記花粉管。

圖2. 根據參考文獻改編轉載。



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圖10使用 ClearSee? 處理4天的擬南芥的根。

圖10. 生長素應答細胞的細胞核用綠色、全身的細胞核用紫色顯示。

圖10. 根據參考文獻改編轉載。



■其他植物的透明化案例


使用 ClearSee? 透明化6天后的藍豬耳、矮牽牛、煙草、番茄、黃瓜、稻葉。

稻葉在透明化時,由于葉子的表面有蠟層,因此很難將溶液滲入組織里,通過在氯仿等有機溶劑中浸泡 10~30 秒除蠟后,開始固定的步驟。


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圖11使用 ClearSee? 透明化的各種植物葉片(6天后)



◆參考文獻


Kurihara, D. et al.: Development142, 4168-4179 (2015).



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產品編號產品名稱產品規格產品等級
031-25151ClearSee?50 mL植物透明化用


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